Métodos

Métodos para a Realização das Principais Linhas de Pesquisa

Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Uso de Animais Experimentais e Comitê de Ética em Pesquisa das Instituições envolvidas. A metodologia será apresentada em função de cada sistema que será estudado: nervoso, cardiovascular, renal, respiratório, digestório, endócrino, locomotor e tegumentar.

Sistema Nervoso:

Os seguintes modelos animais serão tratados com células tronco pluripotentes e adultas: lesão traumática de medula espinal e nervos periféricos, lesão de nervo óptico (modelo de lesão de SNC e de glaucoma), lesão traumática de encéfalo, hipóxia-isquemia cerebral neonatal (modelo de encefalopatia neonatal), isquemia global, isquemia focal, acidente vascular hemorrágico, ELA, doença de Alzheimer, doença de Parkinson. As abordagens utilizadas incluem técnicas de Nanotecnologia para produção de biomateriais (eletrofiação) e fabricação de tubos por extrusão, cultura de células, técnicas de Biologia Celular (imunofenotipagem, imuno-histoquimica, citometria de fluxo), Biologia Molecular, bioimagem de pequenos animais (RMI, PET-CT, ultrasom, bioluminescência). Avaliações funcionais (sensoriais, motoras e cognitivas) através de Catwalk (avaliação automática de parâmetros locomotores), Rotarod (avaliação motora), campo aberto, Optometria (avaliação da função visual), led walk e eletroneuromiografia.

Sistema cardiovascular:

Nos estudos in vitro, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) serão geradas a partir de amostras de sangue periférico humano (veja abaixo). Células-tronco adultas ou progenitoras extraídas de diferentes tecidos serão estudadas por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, qRT-PCR e ensaios funcionais de proliferação, apoptose, resistência REDOX, migração e avaliação do secretoma. Nos estudos pré-clínicos, MSCs, cardiomiócitos derivados de iPSCs ou células progenitoras endoteliais, bem como microvesículas, serão utilizadas em modelos de infarto do miocárdio, infecção com T. cruzi e hipertensão arterial sistêmica e os seguintes parâmetros serão avaliados: clínicos (ECG, ECO e hemodinâmica) e laboratoriais (dosagem de mediadores inflamatórias), histologia, bioluminescência, FISH e qRT-PCR. O coração de rato também será descelularizado e a interação entre cardiomiócitos e a matriz cardíaca descelularizada será avaliada por imunofluorescência, microscopia eletrônica de varredura e transmissão e microscopia de força atômica. A Bioengenharia de vasos sanguíneos, usando modelos artificiais de vasos tridimensionais à base de ácido poliglicólico, incorporados com células progenitoras endoteliais ou MSCs humanas, será também testada. No estudo clínico de fase II serão isoladas células mononucleares derivadas da medula óssea (BMDMC) que serão infundidas na área comprometida para o tratamento de pacientes com isquemia crítica de membros inferiores.

Sistema Renal

Os rins de ratos serão descelularizados e recelularizados e, posteriormente, o projeto prevê uma transição de escalabilidade para ensaios com rins de porcos. Serão utilizadas técnicas de histologia, tomografia computadorizada, ultrasonografia e proteômica para: 1) verificar a total remoção das células presentes no rim, observando-se apenas a matriz extracelular (MEC) e preservação do sistema arterio-venoso renal, 2) comparar as propriedades biomecânicas da matriz durante os diferentes protocolos de descelularização, e 3) quantificar proteína da MEC. Para recelularização, serão utilizadas as seguintes células: células-tronco embrionárias (ESCs) humanas, MSCs, células renais (cultura primária), iPSCs e células endoteliais da veia de cordão umbilical. O processo de recelularização será avaliado utilizando-se técnicas histoquímicas, imunocitoquímicas, proteômica, citológica/estrutural e de Biologia Molecular [micro RNAs (miRNAs)]. As matrizes a serem desenvolvidas com a utilização de biopolímeros serão caracterizadas por análises: i) morfológica (microscopia eletrônica e microtomografia computadorizada); ii) mecânica; iii) química de superfície (espectroscopia de infravermelho); e iv) ensaios biológicos de citotoxicidade de contato direto e de biocompatibilidade.

Sistema Respiratório

Serão desenvolvidos modelos de asma, enfisema, silicose e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) onde serão testadas os efeitos da terapia celular e não-celular (microvesículas), oriundas de diferentes fontes: medula óssea, tecidos adiposo e pulmonar. Ademais, MSCs serão transduzidas para superexpressar fator de crescimento semelhante a insulina (IGF) na asma; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) no enfisema; RNA de interferência para o receptor do fator de crescimento transformador (TGF)-b na silicose; fator de crescimento de queratinócitos (KGF) na SDRA. As MSCs serão também estimuladas com soro ou fluido do lavado broncoalveolar de camundongos e pacientes com asma e enfisema, e serão posteriormente administradas nos diferentes modelos para avaliar uma possível potencialização dos seus efeitos terapêuticos. Serão avaliados: mecânica e histologia pulmonares; níveis de mediadores inflamatórios, fatores de crescimento e microRNAs presentes no tecido pulmonar e no interior das microvesículas. Células-tronco (MSCs, células progenitoras endoteliais, células epiteliais amnióticas) e células maduras (células endoteliais e epiteliais) serão utilizadas no processo de recelularização, que será feito através de instilação por via intratraqueal ou intravenosa, no intuito de consolidar a técnica de bioengenharia tecidual pulmonar. Estudos clínicos de fase II, utilizando MSCs serão realizados em pacientes com enfisema e BMDMC na asma de difícil controle.

Sistema Digestório

Os hepatócitos serão gerados a partir de iPSCs e ESCs. Para a reprogramação direta em hepatócitos, fibroblastos da pele de camundongos serão diretamente reprogramados a iHEP in vitro através da transdução de Foxa e Hnf4a. A análise da diferenciação em hepatócitos será realizada através da observação de modificações morfológicas celulares, expressão de proteínas de hepatócitos e quantificação de transcritos via qRT-PCR. MSCs derivadas de medula óssea de camundongos serão transduzidas utilizando vetores lentivirais para superexpressar HGF ou IGF-1. Para o estudo pré-clínico, utilizaremos os seguintes modelos de indução da lesão hepática: intoxicação com tetracloreto de carbono, tioacetamida e acetaminofen. Os hepatócitos gerados ou MSCs transduzidas com fatores de crescimento serão transplantadas por via intraportal ou intraesplênica e, posteriormente, serão realizadas avaliações bioquímicas, histológicas e morfológicas. Os fígados serão descelularizados, recelularizados e, após sete dias em perfusão contínua no bioreator (pós-injeção), o órgão recelularizado será preparado para caracterização e transplante hepático.

Sistema Endócrino

As ilhotas humanas a serem utilizadas para transplante serão isoladas a partir de pâncreas de doadores em morte encefálica. Após transporte do órgão para o laboratório, em solução de preservação, será realizada a dissociação mecânica e digestão enzimática do tecido, purificação das ilhotas e sua caracterização quanto ao número, viabilidade morfológica e funcional, bem como avaliação microbiológica e eventual presença de endotoxinas. As ilhotas extraídas serão encapsuladas e colocadas em animais de médio porte (minipigs), utilizando-se microcápsulas de Laminina-Biodritina (material desenvolvido e patenteado pelo NUCEL), que se mostrou capaz de manter camundongos diabéticos imunocompetentes euglicêmicos durante mais de 200 dias após receberem ilhotas de ratos encapsuladas com esse biomaterial. Células-tronco embrionárias (ESCs) e iPSCs serão diferenciadas em células produtoras de insulina. Essas células serão usadas para repopular as matrizes tridimensionais obtidos através da descelularização de pâncreas de porco.

Sistema Locomotor

Novos desenhos de materiais cerâmicos, poliméricos e compósitos biomiméticos reabsorvíveis, micro- e nanoestruturados, funcionalizados (ou não) serão processados segundo as boas práticas de fabricação. Técnicas de impressão 3D serão desenvolvidas visando à produção de arcabouços complexos adaptados para associação com células e fatores de crescimento, visado à diferenciação celular. As interações entre biomoléculas, sistemas celulares e materiais serão estudadas quanto à sua(s) atividade(s) biológica(s), composição estrutural, estabilidade genética e vias de sinalização. Análises de genotoxicidade, bem como de estabilidade genética das células na presença dos biomateriais complexos, serão realizadas ao longo do tempo e/ou durante a diferenciação. As matrizes obtidas com as diferentes combinações de células, biomateriais e fatores de crescimento apresentando o maior potencial para o reparo ósseo e cartilaginoso, serão empregadas em estudos pré-clínicos utilizando-se animais de pequeno e médio porte e ensaios clínicos.

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